任政华　房廉洁　刘宝全　李一经　孙国光　

　　摘　要　目的：探讨狂犬病毒N蛋白的免疫原性。方法：采用生物工程技术、基因重组方法。结果：以狂犬病毒基因文库及IL-2基因文库设计两对引物，基因扩增后分别得到完整狂犬病毒N蛋白基因片段(1.4 kb)和IL-2基因片段(0.4 kb)，两基因片段经重组后，构建了狂犬病毒N蛋白及IL-2重组基因工程菌。重组基因产物具有特异性生物活性。用IL-2单抗检测有一定IL-2活性。免疫小鼠后，小鼠可抵抗狂犬病毒脑内攻击。结论：采用的载体及方法、路线可行，重组产物具有生物活性。
　　关键词　狂犬病毒N蛋白　狂犬病毒基因重组　白细胞介素-2

　　中国图书分类号　R373.9

Expression of recombinant rabies virus in Escherichia Coli

REN Zheng-Hua,FANG Lian-Jie,LIU Bao-Quan① et al.
Third Clinical Hospital of Bethune Medical University,Changchun 130031.①Northeast Agricultural University,Harbin150021

Abstract Objective:Study immunogenicity of rabies virus nucleoprotein.Methods:Molecular biology and gene recombination.Results:Had designed two pairs of inductive substance based on gene library of rabies virus and IL-2.After amplification,obtained a gene section of IL-2 of 0.4 kb and one of rabies nucleoprotein of 1.4 kb.With recombination of the two sections,obtained nucleoprotein of rabies virus and IL-2 recombinant.The substance obtained is bio-active and possess certain IL-2 activity.It could induce resistance to rabies virus challenge to the head of the mice.Conclusion:Obtained to activity material from the test.
Key words　Rabies virus nucleoprotein Rabies virus recombinant IL-2

　　狂犬病毒核蛋白(NP)，长期以来一直被认为是结构蛋白，是病毒遗传的主要成分，不具有抗原性［1］。近年来许多专家相继报道核蛋白的免疫保护作用［2］。核蛋白主要作用表现在刺激机体免疫活性细胞增殖，促进细胞免疫，参与免疫调节［3］。但核蛋白只能刺激细胞免疫，不产生中和抗体，核蛋白的免疫原性并不十分理想。为提高核蛋白的免疫原性及生物学效应，本研究通过基因重组方法引入IL-2基因，从而提高核蛋白的免疫原性，达到预防、治疗狂犬病的目的。

1　材料与方法

1.1　材料
1.1.1　狂犬病毒株CVS由中国药品生物制品检定所提供。
1.1.2　白细胞介素-2质粒含IL-2全基因片段由美国Feris实验室赠送。
1.1.3　实验中所用的内切酶、连接酶、T载体等均购自Promege公司，其他试剂购于华美生物工程公司。
1.2　方法
1.2.1　目的基因克隆及重组　以狂犬病毒全基因及IL-2全基因文库设计特异性引物，以狂犬病毒cDNA和IL-2 cDNA为模板，经PCR扩增，调出目的基因，于T载体中克隆，获得足够量基因片段［4］。
1.2.2　重组基因的构建与表达　将两目的基因经修饰连接后，重组于PBV220表达载体中并转化于DH5α受体菌中，得到工程菌。
1.2.3　SDS-PAGE、4.5%浓缩胶、15%分离胶　参见文献［5］。
1.2.4　表达产物生物学鉴定采用ELISA检测IL-2活性　采用小鼠免疫法检测表达产物的抗原性。

2　结果
2.1　目的基因PCR引物设计与扩增　设计两对PCR特异性引物，含有酶切位点及启动子的IL-2引物。含有酶切位点及终止子的狂犬病毒N蛋白基因引物。扩增后得到IL-2 (0.4 kD)和狂犬病毒N蛋白(1.4 kD)基因片段。结果见图1、图2。




图1　构建IL-2和N蛋白的表达载体
Fig.1　Construction of human IL-2 and NP expressing clone



图2　IL-2和狂犬病毒N蛋白扩增产物
Fig.2 Matters of IL-2 and rabies virus nucleoprotein gene by PCR
Note:1. 0.4 kD IL-2 gene;2. 1.4 kD rabies virus nucleoprotein gene;3.λDNA HindⅢ marker

2.2　目的基因构建　将分别获得的IL-2和狂犬病毒N蛋白基因分别连接于T载体中克隆，经特异性酶切后，于PBV220表达载体中构建，得到表达载体(PBIRB vetor)，本表达载体有SD序列和PRPL启动子及T1T2终止子，在ECORI和BamHI两酶切位点之间有IL-2 RB基因，构建图见图1。构建后基因纯化后鉴定结果见图3。



图3　重组基因鉴定
Fig.3　The recombinant gene were identified
Note:1.λ DNA HindⅢ marker; 2. 0.4 kD IL-2 gene and 1.4 kD rabies virus nucleoprotein; 3. 1.8 kD recombinant gene

2.3　目的基因的表达产物鉴定　目的基因于工程菌中转化后，获得产物经IL-2单抗检测结果见表1。表1结果可见，重组产物具有IL-2活性。表达产物免疫小鼠后，以狂犬病毒标准毒株(CVS)攻击小鼠，小鼠有一定保护力。攻毒途径：脑内0.03 ml，含30个LD50病毒。

表1　重组基因表达产物酶联免疫吸附试验结果
Tab.1 The experssion matters of recombinant gene of enzyme linked immnosorbeat assay


Groups

(IL-2 absorb value (OD，±s) Negtive
1∶2 1∶4 1∶8　 1∶16 1∶32
1 0.235±0.04 0.249±0.05 0.276±0.05 0.172±0.04 0.130±0.01 0.119±0.04
2 0.231±0.03 0.262±0.08 0.312±0.04 0.191±0.07 0.090±0.01 0.101±0.03
3 0.256±0.05 0.200±0.04 0.270±0.05 0.190±0.04 0.070±0.02 0.006±0.01
4 0.224±0.03 0.200±0.04 0.254±0.01 0.212±0.06 0.061±0.03 0.009±0.02

3　讨论
　　以狂犬病毒及IL-2基因文库设计2对具有特异性酶切位点引物，经PCR扩增后，得到两条特异性基因片段，分别为IL-2(0.4 kD)和狂犬病毒N蛋白(1.4 kD)。两基因于T载体中克隆后，顺利得到重组子。
　　选用PBV220表达载体，正向插入目的基因，获得表达型特异基因载体，该载体除基因自身的启动子和终止子外，还具有PRPL强启动子和T1T2终止子。于工程菌中表达得到较理想效果。
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