周 卫 何 萍
摘要：应用45Ca2+示踪法研究了苹果果肉质膜微囊依赖于Ca2+的ATP酶（Ca2+-ATP酶）活性与Ca2+运输之间的关系及激素对该酶活性的影响。结果表明：Ca2+-ATP酶存在于质膜上并受载体A23187刺激而活性增加，该酶活性与依赖于ATP的Ca2+运输依抑制剂EB、游离Ca2+和ATP浓度的变化并呈极为相似的饱和动力学特征；而其EB半抑制浓度，Ca2+和ATP半饱和浓度分别为0.1，0.1和 50μmol／L，从而证实了正是Ca2+-ATP酶推动苹果果肉质膜微囊的Ca2+的主动运输。生长素与萘乙酸均可促进苹果果肉质膜微囊Ca2+-ATP酶活性和Ca2+吸收，而赤霉素则无此作用。
关键词：质膜微囊，Ca2+-ATP酶，Ca2+主动运输，激素，苹果果肉
学科分类号：Q946,Q942
Characterization of Ca2+-ATPase Which Drives Active Transport of Ca2+ in Plasma Membrane Vesicles Isolated from Pulp Cell of Malus pumila Fruits
ZHOU Wei and HE Ping
（Soil and Fertilizer Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）
Abstract：The relationship between Ca2+-dependent ATPase（Ca2+-ATPase）and ATP-dependent Ca2+ transport in plasma membrane vesicles isolated from pulp cell of Malus pumila fruits and the influence of hormones on this enzyme were investigated by using 45Ca2+ tracing. Results showed that the Ca2+-ATPase is stimulated by the Ca2+ ionophore A23187（Fig.3） and is localized at the plasma membrane（Fig.1;Tables 1，2）. Ca2+-ATPase activity and ATP-dependent Ca2+ uptake show very similar saturation kinetics with erythrosin B（50% inhibition at about 0.1μmol/L）（Fig.4），free Ca2+（half-maximal rate at about 0.1μmol/L）（Fig.5），and ATP（Km 50μmol／L）（Fig.2），demonstrating that it is this enzyme that drives ATP-dependent Ca2+ transport in plasma membrane vesicles. Both Ca2+-ATPase and Ca2+ uptake could be promoted also by IAA or NAA，but none by GA（Fig.6）.
Key words：plasma membrane vesicles，Ca2+-ATPase，Ca2+ transport，hormone， pulp cell of Malus pumila fruits
Ca2+能直接参与调节植物细胞内许多重要生理生化过程(周卫和林葆1995a，1995b，1996；Huang等1996；Paul等1996)。正常条件下，陡电化学势梯度有利于胞外Ca2+直接进入胞质（Donald 1990），但胞质内Ca2+必须保持极低的浓度（10-7～10-6mol／L）。胞质的低Ca2+浓度主要通过胞质Ca2+跨液泡膜、线粒体膜及内质网膜等膜系统主动运输进入细胞器，或由跨质膜主动运输进入胞外空间而实现的(Hepler和Wayne 1985)。研究表明，Ca2+跨膜运输包括初级主动运输和次级主动运输两方面。初级主动运输可由结合在内质网膜上依赖于Mg-ATP的Ca2+吸收系统(Bush等1986)和结合在质膜上依赖于钙调蛋白的ATP酶而完成(Zocchi和Hanson 1983，Askerlund 1996)；次级主动运输则是由液泡膜上的H+-ATP酶作为质子泵，使液泡内H+积累，液泡内的H+可与胞质Ca2+逆向运输，从而维持胞内的低Ca2+浓度（Schumaker和Sze 1985，Blumwald 1986）。有研究发现，甜菜贮藏组织内质网膜上存在依赖于Mg-ATP和Ca2+的主动运输Ca2+的ATP酶(即Ca2+-ATP酶), 它受Ca2+ 载体A23187刺激而活性增加(John等 1987)；萝卜幼苗质膜微囊上亦存在着依赖于Ca2+的运输系统(Rasi-Caldgno等1989，1992)；质膜微囊Ca2+-ATP酶特性因供试材料不同而差别很大（Williams等1990，Rasi-Caldgno 等1992）。而有关苹果果肉质膜微囊Ca2+-ATP酶与Ca2+运输的关系尚未见报告, 亚细胞水平外源激素如生长素、萘乙酸和赤霉素等对该酶活性及Ca2+运转的影响很不明确。
本实验以苹果幼果为试材，在对果肉细胞膜微囊Ca2+-ATP酶定位的基础上，着重研究质膜微囊Ca2+-ATP酶性质及其与Ca2+运转的关系，以及外源激素对该过程的影响，旨在对胞内Ca2+参与细胞生理生化过程的方式作进一步的了解。
1 材料与方法
1.1 果肉质膜微囊制备 参照郝鲁宁和余叔文（1992）、Rasi-Caldgno等(1989)的方法略加改动，即先用EGTA去除膜微囊吸附的Ca2+，缓冲液不加ATP。取新鲜苹果（Malus pumila）幼果的果肉30g，按1.5ml/g鲜果肉加入预冷的匀浆缓冲液（mmol/L） ［蔗糖250, KI 125, EGTA 3, Hepes-Tris (pH 7.5)25, 10%（W/V）甘油，0.5%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（30K），0.5%(W/V)BSA, DTT 1, PMSF 1］中，经匀浆化和差速离心，沉淀用匀浆缓冲液洗涤3次；再以少量悬浮液Ⅰ（mmol/L） ［蔗糖250, Hepes-Tris (pH 7.2)2.5,10%（W/V）甘油，0.2%(W/V)BSA, DTT 1］悬浮，此为微粒体膜制剂。连续线性（20%～45%）和不连续（28%，34%和45%）蔗糖密度梯度离心，梯度时间分别为15和2h，收取34%～45%蔗糖浓度界面，此为纯化质膜制剂。
梯度离心样品经悬浮液Ⅱ（mmol／L） ［KCl 125, Hepes-Tris (pH 7.5)2.5, DTT 0.2］悬浮后，80000×g差速离心30min，将等体积少量悬浮液Ⅱ和Ⅲ（mmol/L）［山梨醇250, Hepes-Tris 2.5(pH 7.5), DTT 0.2］混合，用混合液在0℃下处理所得沉淀15min，再以悬浮液Ⅲ稀释，得到密闭质膜微囊制剂。样品用液氮保存，3d内进行Ca2+运转观察，并进行有关酶活性与膜蛋白含量的测定。
1.2 跨膜Ca2+转运测定 参照Rasi-Caldgno等(1989，1992)、郝鲁宁和余叔文（1992）的方法略加修改。标准的测定系统组成（mmol／L）：山梨醇250, Hepes-Tris (pH 7.5)25, KNO3 100, NaN3 0.4, MgSO4 3, ATP 3或在ATP浓度实验中根据需要设定，CaCl2 50μmol/L或与EGTA 0.5mmol/L 形成一定的游离Ca2+浓度的缓冲体系(含0.5μCi的45Ca2+，需按实际同位素比活折算出加入45Ca2+量)；外源激素处理中激素浓度(mg／L): IAA 50，NAA 50,GA 50；加入50μl 膜制剂（含10～30μg膜蛋白）。于25℃下启动反应，系统终体积为0.2ml。反应一定时间后，立即加入1ml终止液（mmol/L）［蔗糖250, Hepes-Tris (pH 7.5) 25, MgSO4 2, EGTA 2］终止反应。精确吸取反应液1.0ml，加至微孔滤器滤膜上真空超滤。滤膜孔径0.22μm，预先用CaCl2 1mmol／L代替EGTA的终止液浸泡至少1h。2ml终止液清洗滤膜3次，置红外灯下烘干。烘干的滤膜浸入5ml闪烁液中，用Beckman LS-9800闪烁计数器测定同位素量。微囊对45Ca2+的主动吸收量需扣除不加ATP时的被动吸附部分。
收藏该论文到书签
上一页12 3 4 下一页
摘要：应用45Ca2+示踪法研究了苹果果肉质膜微囊依赖于Ca2+的ATP酶（Ca2+-ATP酶）活性与Ca2+运输之间的关系及激素对该酶活性的影响。结果表明：Ca2+-ATP酶存在于质膜上并受载体A23187刺激而活性增加，该酶活性与依赖于ATP的Ca2+运输依抑制剂EB、游离Ca2+和ATP浓度的变化并呈极为相似的饱和动力学特征；而其EB半抑制浓度，Ca2+和ATP半饱和浓度分别为0.1，0.1和 50μmol／L，从而证实了正是Ca2+-ATP酶推动苹果果肉质膜微囊的Ca2+的主动运输。生长素与萘乙酸均可促进苹果果肉质膜微囊Ca2+-ATP酶活性和Ca2+吸收，而赤霉素则无此作用。
关键词：质膜微囊，Ca2+-ATP酶，Ca2+主动运输，激素，苹果果肉
学科分类号：Q946,Q942
Characterization of Ca2+-ATPase Which Drives Active Transport of Ca2+ in Plasma Membrane Vesicles Isolated from Pulp Cell of Malus pumila Fruits
ZHOU Wei and HE Ping
（Soil and Fertilizer Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）
Abstract：The relationship between Ca2+-dependent ATPase（Ca2+-ATPase）and ATP-dependent Ca2+ transport in plasma membrane vesicles isolated from pulp cell of Malus pumila fruits and the influence of hormones on this enzyme were investigated by using 45Ca2+ tracing. Results showed that the Ca2+-ATPase is stimulated by the Ca2+ ionophore A23187（Fig.3） and is localized at the plasma membrane（Fig.1;Tables 1，2）. Ca2+-ATPase activity and ATP-dependent Ca2+ uptake show very similar saturation kinetics with erythrosin B（50% inhibition at about 0.1μmol/L）（Fig.4），free Ca2+（half-maximal rate at about 0.1μmol/L）（Fig.5），and ATP（Km 50μmol／L）（Fig.2），demonstrating that it is this enzyme that drives ATP-dependent Ca2+ transport in plasma membrane vesicles. Both Ca2+-ATPase and Ca2+ uptake could be promoted also by IAA or NAA，but none by GA（Fig.6）.
Key words：plasma membrane vesicles，Ca2+-ATPase，Ca2+ transport，hormone， pulp cell of Malus pumila fruits
Ca2+能直接参与调节植物细胞内许多重要生理生化过程(周卫和林葆1995a，1995b，1996；Huang等1996；Paul等1996)。正常条件下，陡电化学势梯度有利于胞外Ca2+直接进入胞质（Donald 1990），但胞质内Ca2+必须保持极低的浓度（10-7～10-6mol／L）。胞质的低Ca2+浓度主要通过胞质Ca2+跨液泡膜、线粒体膜及内质网膜等膜系统主动运输进入细胞器，或由跨质膜主动运输进入胞外空间而实现的(Hepler和Wayne 1985)。研究表明，Ca2+跨膜运输包括初级主动运输和次级主动运输两方面。初级主动运输可由结合在内质网膜上依赖于Mg-ATP的Ca2+吸收系统(Bush等1986)和结合在质膜上依赖于钙调蛋白的ATP酶而完成(Zocchi和Hanson 1983，Askerlund 1996)；次级主动运输则是由液泡膜上的H+-ATP酶作为质子泵，使液泡内H+积累，液泡内的H+可与胞质Ca2+逆向运输，从而维持胞内的低Ca2+浓度（Schumaker和Sze 1985，Blumwald 1986）。有研究发现，甜菜贮藏组织内质网膜上存在依赖于Mg-ATP和Ca2+的主动运输Ca2+的ATP酶(即Ca2+-ATP酶), 它受Ca2+ 载体A23187刺激而活性增加(John等 1987)；萝卜幼苗质膜微囊上亦存在着依赖于Ca2+的运输系统(Rasi-Caldgno等1989，1992)；质膜微囊Ca2+-ATP酶特性因供试材料不同而差别很大（Williams等1990，Rasi-Caldgno 等1992）。而有关苹果果肉质膜微囊Ca2+-ATP酶与Ca2+运输的关系尚未见报告, 亚细胞水平外源激素如生长素、萘乙酸和赤霉素等对该酶活性及Ca2+运转的影响很不明确。
本实验以苹果幼果为试材，在对果肉细胞膜微囊Ca2+-ATP酶定位的基础上，着重研究质膜微囊Ca2+-ATP酶性质及其与Ca2+运转的关系，以及外源激素对该过程的影响，旨在对胞内Ca2+参与细胞生理生化过程的方式作进一步的了解。
1 材料与方法
1.1 果肉质膜微囊制备 参照郝鲁宁和余叔文（1992）、Rasi-Caldgno等(1989)的方法略加改动，即先用EGTA去除膜微囊吸附的Ca2+，缓冲液不加ATP。取新鲜苹果（Malus pumila）幼果的果肉30g，按1.5ml/g鲜果肉加入预冷的匀浆缓冲液（mmol/L） ［蔗糖250, KI 125, EGTA 3, Hepes-Tris (pH 7.5)25, 10%（W/V）甘油，0.5%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（30K），0.5%(W/V)BSA, DTT 1, PMSF 1］中，经匀浆化和差速离心，沉淀用匀浆缓冲液洗涤3次；再以少量悬浮液Ⅰ（mmol/L） ［蔗糖250, Hepes-Tris (pH 7.2)2.5,10%（W/V）甘油，0.2%(W/V)BSA, DTT 1］悬浮，此为微粒体膜制剂。连续线性（20%～45%）和不连续（28%，34%和45%）蔗糖密度梯度离心，梯度时间分别为15和2h，收取34%～45%蔗糖浓度界面，此为纯化质膜制剂。
梯度离心样品经悬浮液Ⅱ（mmol／L） ［KCl 125, Hepes-Tris (pH 7.5)2.5, DTT 0.2］悬浮后，80000×g差速离心30min，将等体积少量悬浮液Ⅱ和Ⅲ（mmol/L）［山梨醇250, Hepes-Tris 2.5(pH 7.5), DTT 0.2］混合，用混合液在0℃下处理所得沉淀15min，再以悬浮液Ⅲ稀释，得到密闭质膜微囊制剂。样品用液氮保存，3d内进行Ca2+运转观察，并进行有关酶活性与膜蛋白含量的测定。
1.2 跨膜Ca2+转运测定 参照Rasi-Caldgno等(1989，1992)、郝鲁宁和余叔文（1992）的方法略加修改。标准的测定系统组成（mmol／L）：山梨醇250, Hepes-Tris (pH 7.5)25, KNO3 100, NaN3 0.4, MgSO4 3, ATP 3或在ATP浓度实验中根据需要设定，CaCl2 50μmol/L或与EGTA 0.5mmol/L 形成一定的游离Ca2+浓度的缓冲体系(含0.5μCi的45Ca2+，需按实际同位素比活折算出加入45Ca2+量)；外源激素处理中激素浓度(mg／L): IAA 50，NAA 50,GA 50；加入50μl 膜制剂（含10～30μg膜蛋白）。于25℃下启动反应，系统终体积为0.2ml。反应一定时间后，立即加入1ml终止液（mmol/L）［蔗糖250, Hepes-Tris (pH 7.5) 25, MgSO4 2, EGTA 2］终止反应。精确吸取反应液1.0ml，加至微孔滤器滤膜上真空超滤。滤膜孔径0.22μm，预先用CaCl2 1mmol／L代替EGTA的终止液浸泡至少1h。2ml终止液清洗滤膜3次，置红外灯下烘干。烘干的滤膜浸入5ml闪烁液中，用Beckman LS-9800闪烁计数器测定同位素量。微囊对45Ca2+的主动吸收量需扣除不加ATP时的被动吸附部分。
收藏该论文到书签
上一篇：24-表油菜素内酯对盐藻细胞分裂的促进作用及与Ca2+和钙调素的关系 下一篇：没有了
Tags:
评论列表