魏军　　张正

　　【摘要】　目的　建立聚合酶链反应(PCR)产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒(HPV)型别鉴定。方法　利用HPV通用引物介导PCR（GP-PCR）扩增靶DNA，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（HRP-PEI-QI）,与预先包被在微孔板上的HPV寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果　HPV各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达13～76个病毒DNA拷贝，比PCR-琼脂糖凝胶电泳检测高10倍；该法重复性好，阳性孔批内CV为6.34%，批间CV为10.53%，阴性孔批内CV为1%，批间CV为5.79%；而且杂交影响因素较少。结论　该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和E.B.染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。
　　【关键词】　人乳头瘤病毒　　杂交　　聚合酶链反应

A novel method of directly labeling PCR products and hybridization in microplate for typing human papillomaviruses　Wei Jun, Zhang Zheng. Clinical Lab, Afflicted Hospital, Beijing Medical University, Beijing, 100044
　　【Abstract】　Objective　To develop a easy method for detecting and typing HPVs.Method　General primer mediated PCR (GP-PCR) was applied successfully to detect a broad spectrum of HPV in cervical scrapes and paraffin wax embedded specimens diagnosed pathologically as squamous cell carcinoma of the cervix uterine. To facilitate HPV typing, a calorimetric microplate base hybridization assay was developed. The PCR products were directly labeled with HRP complex (HRP-PEI-PBQ). The microplate was previously covered with avian which can bind a biotinylated HPV-probe, then fixed with the biotinylated HPV genomic probes mix and type specific probes respectively. Hybridization was completed in a short time and the hybridized signal was detected by ELISA-like assay.Results　Since this method is highly specific, no cross-hybridization was noted between all types of HPVs. The sensitivity was ten times higher than that of agrose-electrophic the lowest concentration of template was 13-76 copies of HPV DNA.Conclusion　The method is of potential use for routine HPV examination of clinical specimens.
　　【Key words】　Human papillomavirus　　Hybridization　　Polymerase chain reaction

　　目前已知，人乳头瘤病毒(HPV)与人类疾病，特别是恶性肿瘤及癌前病变密切相关［1］，其致病性与型别有关。因此，HPV临床检测，尤其是型别鉴定，日益受到重视，临床上有必要建立一种简便、快速、灵敏、特异的分型检测方法。
　　我们选用Manos等［2］设计的一对能与多型HPV退火的通用引物进行聚合酶链反应(PCR)，建立了PCR-微孔板反向分子杂交法进行HPV分型检测,现将结果报告如下。

材料与方法

　　一、材料
　　1.标本来源：临床标本共100份，取自宁夏医学院附属医院、北京妇产医院和山东菏泽医院，其中病理诊断为低分化鳞癌的宫颈石蜡切片40份；宫颈刮片或活检组织40份；正常宫颈石蜡切片20份。
　　2.主要试剂与仪器：HPV16重组质粒DNA由北京医科大学口腔医院李盛琳老师惠赠；HPV18型DNA从Hella细胞中提取。dNTP为Boehringer Mannheim 产品；Taq DNA聚合酶和PCR Marker为Promega产品；亲合素、戊二醛和N-羟基琥珀亚胺(长链生物素)为Sigma产品；HRP复合物为北京人民医院血液病研究所产品；酶标板为丹麦Nunc公司产品；DNA扩增仪480型为美国PE公司产品。
　　二、方法
　　1. 引物和寡核苷酸探针：根据文献［2］，引物是从HPV L1区中选择保守序列设计，上游引物MY11为5′-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3′，下游引物MY09为5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′(M=A+C,R=A+G,W=A+T,Y=C+T)，由人民医院中心实验室合成，预期扩增片段为450 bp；基因组混合探针（GP）序列选自HPV L1区中另一保守序列，可与MY11和MY09引物产生的多种HPV扩增产物杂交；HPV基因组混合探针和HPV16型特异探针（MY14）3′端均标记生物素，HPV18型特异探针（WD74）5′端标记氨基，按文献［3］标记生物素。寡核苷酸探针均由美国Synbercen公司合成。
　　2. PCR模板制备：按文献［4］制备，取上清液5 μl用于PCR检测。
　　3. 聚合酶链反应：循环参数如下：94℃，预变性5分钟；然后94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，45秒；循环35圈；最后72℃继续延伸5分钟。取10 μl产物于1.8%琼脂糖凝胶上电泳，观察在450 bp处有无扩增带或进行微孔板杂交。
　　4. 产物直接标记辣根过氧化物酶复合物：取PCR产物10 μl，94℃10分钟，立即冰浴5分钟；加入HRP标记物10 μl，戊二醛试剂10 μl，混匀，短暂离心后于37℃30分钟，进行标记。
　　5. 微孔板杂交：每孔加入100 μl亲合素(10 μg/ml)，4℃过夜；PBS洗板3次；加入生物素标记的探针100 μl (探针终浓度为33 μmol/L)，室温作用1小时，PBS洗板3次；每孔加入杂交液100 μl(主要成分为含6mmol/L尿素的Tris-HCl)，然后加入HRP标记的产物15 μl， 42℃杂交20分钟，PBS洗板3次，加入底物液100 μl(0.1mol/L柠檬酸钠，pH 5.5，0.01% TMB，0.03% H2O2)，室温5～10分钟，加入1 mol/L H2SO4 50 μl 终止显色，450/630nm读取吸光度A值。

结果

　　1. 微孔板杂交特异性实验：将HPV16和18标准DNA扩增产物分别与公用混合探针、16型、18型特异探针杂交，结果表明HPV16和18型产物均能与公用混合探针杂交，但HPV16型产物仅与16型特异探针杂交，而18型产物也仅与18型特异探针杂交，两产物间无交叉反应。说明杂交特异性强。
　　2. 微孔板杂交灵敏度试验：将模板Hela DNA(HPV18+)稀释成40 ng、4 ng、400 pg、40 pg、4 pg、400 fg、40 fg和4 fg8个浓度分别进行扩增，然后同时用琼脂糖凝胶电泳和杂交分别检测产物
，结果见附图。




1：阴性对照；M：DNA Marker；2～9：模板浓度分别为
40、4 ng，400、40、4 pg；400、40、4 fg
附图　PCR-琼脂糖凝胶电泳灵敏度试验结果
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