康继超　沙木屯布卡1　贺师鹏2　谢蜀生1　魏树礼
(北京 100083 北京医科大学药剂教研室；1 北京医科大学免疫药理研究室；2 北京医科大学同位素室)

摘要　目的：研究磁性微球与单克隆抗体结合的条件，以构建具有良好性能的免疫磁性微球。方法：以同位素标记的单克隆抗体和微球的结合率为指标。用均匀设计法研究影响免疫磁性微球构建的因素。结果：pH值、抗体加入量和反应时间是影响免疫磁性微球构建的主要因素。结论：通过控制条件，可以构建具有良好性能的免疫微球。
关键词　免疫磁性微球；同位素标记抗体；均匀设计法

Optimal construction of an immunomagnetic microspheres by 125　I labelled antibody methods

Kang Jichao (Kang JC), Santem Buka (Santem BK), He Shipeng (He SP),
et al (Department of Pharmaceutics, Beijing Medical University, Beijing 100083)

ABSTRACT　OBJECTIVE: To study the factors affecting the binding of monoclonal antibodies to made magnetic microspheres in order to construct an immunomagnetic microspheres that have good properties. METHODS: What determines the binding percent of monoclonal antibodies to make magnetic beads is studied by uniform design methods, isotope marked antibody's binding percent as the criteria. RESULTS: The main factors affecting the construction of an immunomagnetic microspheres included pH, the amount of antibodies added, reaction time. CONCLUSION: By selecting the antibodies binding conditions, immunomagnetic microspheres which have good properties can be easily constructed.
KEY WORDS　immunomagnetic microspheres, isotope marked antibodies, uniform design methods

　　在过去10多年中，高剂量化疗后给予自身骨髓移植(ABMT)用于乳腺癌［1］和小细胞肺癌［2］等治疗取得了令人鼓舞的结果。但是，ABMT时，肿瘤转移细胞有可能累及骨髓。因此，在体外清除骨髓中的癌细胞是保证ABMT成功的必要条件。已发展起来的用于体外净化骨髓的方法中，运用免疫磁性微球(immunomagnetic microspheres IMMS)物理地清除癌细胞的方法具有安全、效果好、操作简便的特点，在国外已经应用于临床，国内尚属空白［3］。
　　IMMS表面结合抗体的多少，直接决定着IMMS与细胞的结合能力，是一个关键指标。本实验以同位素标记的单克隆抗体和微球的结合率为指标，用均匀设计法研究了影响免疫磁性微球构建的主要因素，旨在构建一种具有良好性能的免疫磁性微球。

1　材料和方法

1.1　仪器与试剂
　　Beckman DP5500 γ计数器，荧光显微镜(NICON)；ZW2080核酸蛋白检测仪(上海自动化仪表厂)。Protein G(德国Boehringer Mannheim公司)；Na125 I(中国科学院原子能所)；异硫氰酸荧光素(FITC)标记兔抗鼠抗体(北京医科大学免疫药理室自制)；BALB/C小鼠(本校实验中心)；牛血清白蛋白(BSA)(上海向阳制药厂)。
　　单克隆抗体：BDI-1系北京医科大学免疫药理研究室建株，能稳定地分泌抗人膀胱癌的杂交瘤细胞株。BALB/C ♀成年小鼠ip降值烷0.5 ml，10 d后，ip杂交瘤细胞5×106，10 d～14 d后收集腹水，500 gL-1和330 gL-1的饱和硫酸铵两次沉淀，透析除盐，Agros Protein-G亲和层析后得纯化的抗人膀胱癌单抗(属IgG1亚类)。经间接免疫荧光法检测，效价可达1∶20 000以上。聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实其中不含杂蛋白。抗体浓度为3 mgml-1，加NaN3后于-20 ℃冻存。
　　聚苯乙烯磁性微球(PMMS)：为本室自制，先制得大粒径、单分散的多孔聚苯乙烯微球［4］，再用硫酸亚铁处理使其磁化，最后在表面聚合一层聚丙烯醛膜，以利于抗体的连接。所制PMMS直径为3.57 μm，分散度为0.08，磁铁含量为12.94%，磁性物质为γ-Fe2O3。饱和磁响应强度为7.96×106 Am2kg-1，剩磁为1.30×106 Am2kg-1［5］。
1.2　单抗的125 I标记
　　采用Iodogen法，取少量Iodogen的CH2Cl2溶液于试管中微热，使溶剂挥发后形成Iodogen膜。加入0.5 ml的磷酸盐缓冲液(0.2 molL-1，pH=7.4)，再相继加入3 μl的Na125 I(10 360 MBq)，50 μl的单克隆抗体(3 mgml-1)，反应10 min，过G-25柱子(洗脱液为0.05 molL-1的磷酸盐缓冲液)，每管0.5 ml，收集洗脱液，γ计数器上测每管活度，取标记蛋白峰。
1.3　抗体与PMMS结合条件的优化
1.3.1　采用均匀设计法研究单抗与PMMS结合条件　按表1安排三因素，六水平实验，研究pH值、抗体加入量、反应时间对单抗与PMMS的结合的影响。实验步骤为：取PMMS于实验管中，每管2 mg，用0.1 molL-1的磷酸盐缓冲液洗涤2次，向各管中加入不同量125 I标记BDI-1单克隆抗体，再分别加入不同pH值的磷酸盐缓冲液(0.1 molL-1)至1 ml，室温旋转，于预定时间取下，洗入新实验管中，用含0.1% BSA的PBS(0.01 molL-1，pH=7.4)洗涤至上清液中含标记抗体的量恒定，γ计数器计数。根据反应前后放射性同位素活度的比值，计算单位质量微球结合抗体的量和结合抗体百分率。
1.3.2　单因素实验法确定微球与抗体的结合条件　在均匀设计实验的基础上，用单因素实验法进一步研究抗体加入量和反应时间对PMMS与抗体结合的影响。实验步骤同上。
1.4　免疫磁性微球表面结合抗体活性的检测
　　用间接免疫荧光法测定免疫磁性微球表面抗体的活性。取结合上抗体的免疫磁性微球，用含0.1% BSA的PBS封闭后，加入少许FITC标记的兔抗鼠抗体，4 ℃反应30 min。用荧光洗涤液洗涤3次，于荧光显微镜下观察荧光。

2　实验结果

2.1　均匀设计法实验结果
　　均匀设计法实验的结果见表1。设单位微球结合量为Y，单位微球结合率为Z，X1为反应时间，X2为抗体加入量，X3为pH值，用Excel进行多元线性拟合后得到Y，Z对X1，X2，X3的拟合方程：

Y=0.054X1+0.007 5X2-0.69X3+5.97(P≤0.159)
Z=0.000 49X1-0.000 05X2-0.003 8X3+0.050(P≤0.184)

　　从拟合方程可以看出，反应时间越长、pH值越低、抗体加入量越大，单位微球结合抗体的量越高；反应时间越长、pH越低、抗体加入量越少，单位微球结合抗体的百分率就越高。以单位微球结合量为指标确定了试验的最优条件同时进行验证，结果发现试验值要比预测值还要高，更好于均匀设计试验各组的结果。
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