张宏 吴绍熙 郭宁如 徐贤秀 沈永年 RoyL.Hopfer
【摘要】 目的 为了判断临床和实验室标本中是否存在病原性真菌。方法 设计了一个以热启动聚合酶链反应(PCR)为基础的实验方法，以一段真菌特异性DNA序列作为通用引物进行检测。引物序列为：①AACTTAAAGGAATTGACGGAAG；②GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC。结果 该法能在3小时之内对所用的全部23种共42株重要病原性真菌及经培养证实有真菌的22份临床标本成功地扩增出一条310bp的DNA片段，但对其它微生物和人体细胞均未扩增出类似片段。该法敏感性高，特异性强。结论 采用通用性强的引物系统配合特异性高的热启动PCR技术检测临床和实验室标本中是否存在病原性真菌的方法有重要的应用潜力。
【关键词】 病原性真菌 聚合酶链反应
Experimental and Clinical Study on Detection of Medically Import ant Fungi by PCR with A Universal Fungus-specific Primer System Zhan g Hong, Wu Shaoxi, Guo Ningru, et al. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To detect pathologic fungi existed in experimental or clinical specimens. Methods A hot-initiated pol ymerase chain reaction (PCR)-based method with a set of universal fungus-speci f ic primers that are capable of detecting a wide range of medically important fun g i is developed in this paper. Such primers allow specific amplification of fung al DNA but not other eukaryotes or prokaryotes. The gene sequences are:①AACTTAA AGGAATTGACGGAAG;②GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC. Results A 310bp pro duct was successfully amplified from all 42 strains of 23 fungal species studied , and from 22 culture-proved clinical specimens within 3 hours, but not from an y strains of other microbes and human cells. This detection system is of high se nsitivity. Conclusion This highly universal primer system in combinaition with highly specific hot-initiated PCR might be used in the detection of medically important fungi in experimental or clinic al specimens.
【Key words】 Fungus Polymerase chain reaction
近年来，真菌对人类感染和致病的机会日益增加。根据美国药品监测网(National Drug Surveillance Network)的资料，1988年在住院患者中真菌感染分离阳性率达1.3%［1］。在中国，过去20年中深部真菌感染率增加40倍［2］。住院患者出现条件致病性真菌感染后病死率高达29%，而无真菌感染者病死率仅17%［1］。因此对其早期诊断、及时治疗甚为重要。在生物进化过程中，真菌存在着不同于其它病原体和动物细胞的、变化极小的界特异性保守基因序列(如18SrRNA的编码基因)［3，4］，可用特异性手段检测之。依此理论，我们选用一段真菌界保守序列作为特异性通用引物，以聚合酶链反应(PCR)为检测手段，对含有常见病原真菌的实验室和临床标本进行研究，以判断该方法的特异性、敏感性和临床应用前景。
资料和方法
(一)菌种：所用菌种均为标准菌株：红色毛癣菌ID5a、ID5b株，须癣毛癣菌ID8a、ID8b株，玫瑰色毛癣菌ID6株，石膏小孢子菌ID3a、ID3b、ID3c株，犬小孢子菌ID2c、ID2d株，絮状表皮癣菌ID14a、ID14b株，申克孢子丝菌ID22a、ID22b、ID22c株，烟曲霉ID52b株，黄曲霉ID113株，杂色曲霉ID108a株，岛青霉AS34025株，马内菲青霉ID43株，裴氏着色真菌ID60d、ID60e株，紧密着色真菌ID29c、ID29d、ID29e株，皮炎万氏霉ID47c株，疣状瓶霉ID30c、ID30g株，甄氏外瓶霉ID13b株，白念珠菌ID16a、ID16c、ID16f、ID16u、ACCC2002株，热带念珠菌ID17c株，乳酒念珠菌ID64b株，高里念珠菌ID21a株，新生隐球菌ID25j、ID25m、ID25u、ID25w株，罗伦隐球菌ID95v株等真菌菌株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心，金黄色葡萄球菌CMCC26063株，大肠杆菌AS1505株，普通变形杆菌CMCC49101株，粪链球菌CMCC32221株，痢疾志贺氏菌CMCC51313株，淋病奈瑟球菌CMCC29106株，沙门氏菌属CMCC50336株，脆弱类杆菌CMCC81301株，青春双歧杆菌CMCC80202株，梭杆菌CMCC86102株，钩端螺旋体CMCC57603株，肺炎支原体CMCC97007株，解脲支原体CMCC99002株，星形奴卡氏菌ID356株等微生物来源于上海第二医科大学。
(二)试剂：原生质体形成缓冲液、原生质体裂解缓冲液按文献［5］配制，Novozym234系丹麦Novo Biolabs产品，TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs系美国Promega产品，Gene Releaser为美国Bioventure产品。
(三)反应模板制备：真菌基因组DNA的小量快速制备方法参照文献［5］，其它微生物和人体细胞(白细胞8份、表皮细胞4份)DNA的制备按文献［4］进行。
(四)临床标本处理：取临床标本(血液、组织、痰、甲屑等)10μl至PCR反应管中，加入Gene Releaser10μl、液体石蜡油30μl，沸水浴10分钟后用作反应模板。
(五)PCR反应及其质量控制：
1.引物：本研究使用的一对引物为真菌18SrDNA上的一段保守序列。经查阅Genebank确认与其它已知序列的物种无同源性。其碱基序列为：①AACTTAAA
GGAATTGACGGAAG；②GCATCACAGACCTGTTATTGCCT
C。可扩增出310bp的DNA片段。
2.反应体系：总体积50μl。其中含dNTPs200μmol/L、MgCl22mmol/L、引物各0.2μmol/L、10×PCR缓冲液5μl、TaqDNA聚合酶2U、模板DNA1μl或临床标本10μl。
3.反应条件及扩增产物检测：采用热启动方式。将除TaqDNA聚合酶以外的其它成分充分混匀，覆30μl液体石蜡油，在DNA热循环仪(Perkin Elmer)上加热至80℃时加入TaqDNA聚合酶，按以下条件扩增：94℃充分变性3分钟后，以94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟循环30次，72℃充分延伸5分钟。取10μl水相扩增产物作琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，中波紫外线观察、照相。
4.质量控制：每次实验均设置阴性和阳性对照，每份标本重复2次，结果相同者判为有效，否则再重做一次。并严格按Kwok等［6］的防污措施进行操作。
结 果
(一)热启动PCR用于检测真菌DNA的特异性：以本法对23种共42株医学上重要的真菌均如期扩增出一条310bp左右DNA片段(图1)，但对细菌、支原体、螺旋体、放线菌、人体细胞等均未能扩增。无模板的反应体系亦未能扩增出阳性结果。
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【摘要】 目的 为了判断临床和实验室标本中是否存在病原性真菌。方法 设计了一个以热启动聚合酶链反应(PCR)为基础的实验方法，以一段真菌特异性DNA序列作为通用引物进行检测。引物序列为：①AACTTAAAGGAATTGACGGAAG；②GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC。结果 该法能在3小时之内对所用的全部23种共42株重要病原性真菌及经培养证实有真菌的22份临床标本成功地扩增出一条310bp的DNA片段，但对其它微生物和人体细胞均未扩增出类似片段。该法敏感性高，特异性强。结论 采用通用性强的引物系统配合特异性高的热启动PCR技术检测临床和实验室标本中是否存在病原性真菌的方法有重要的应用潜力。
【关键词】 病原性真菌 聚合酶链反应
Experimental and Clinical Study on Detection of Medically Import ant Fungi by PCR with A Universal Fungus-specific Primer System Zhan g Hong, Wu Shaoxi, Guo Ningru, et al. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To detect pathologic fungi existed in experimental or clinical specimens. Methods A hot-initiated pol ymerase chain reaction (PCR)-based method with a set of universal fungus-speci f ic primers that are capable of detecting a wide range of medically important fun g i is developed in this paper. Such primers allow specific amplification of fung al DNA but not other eukaryotes or prokaryotes. The gene sequences are:①AACTTAA AGGAATTGACGGAAG;②GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC. Results A 310bp pro duct was successfully amplified from all 42 strains of 23 fungal species studied , and from 22 culture-proved clinical specimens within 3 hours, but not from an y strains of other microbes and human cells. This detection system is of high se nsitivity. Conclusion This highly universal primer system in combinaition with highly specific hot-initiated PCR might be used in the detection of medically important fungi in experimental or clinic al specimens.
【Key words】 Fungus Polymerase chain reaction
近年来，真菌对人类感染和致病的机会日益增加。根据美国药品监测网(National Drug Surveillance Network)的资料，1988年在住院患者中真菌感染分离阳性率达1.3%［1］。在中国，过去20年中深部真菌感染率增加40倍［2］。住院患者出现条件致病性真菌感染后病死率高达29%，而无真菌感染者病死率仅17%［1］。因此对其早期诊断、及时治疗甚为重要。在生物进化过程中，真菌存在着不同于其它病原体和动物细胞的、变化极小的界特异性保守基因序列(如18SrRNA的编码基因)［3，4］，可用特异性手段检测之。依此理论，我们选用一段真菌界保守序列作为特异性通用引物，以聚合酶链反应(PCR)为检测手段，对含有常见病原真菌的实验室和临床标本进行研究，以判断该方法的特异性、敏感性和临床应用前景。
资料和方法
(一)菌种：所用菌种均为标准菌株：红色毛癣菌ID5a、ID5b株，须癣毛癣菌ID8a、ID8b株，玫瑰色毛癣菌ID6株，石膏小孢子菌ID3a、ID3b、ID3c株，犬小孢子菌ID2c、ID2d株，絮状表皮癣菌ID14a、ID14b株，申克孢子丝菌ID22a、ID22b、ID22c株，烟曲霉ID52b株，黄曲霉ID113株，杂色曲霉ID108a株，岛青霉AS34025株，马内菲青霉ID43株，裴氏着色真菌ID60d、ID60e株，紧密着色真菌ID29c、ID29d、ID29e株，皮炎万氏霉ID47c株，疣状瓶霉ID30c、ID30g株，甄氏外瓶霉ID13b株，白念珠菌ID16a、ID16c、ID16f、ID16u、ACCC2002株，热带念珠菌ID17c株，乳酒念珠菌ID64b株，高里念珠菌ID21a株，新生隐球菌ID25j、ID25m、ID25u、ID25w株，罗伦隐球菌ID95v株等真菌菌株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心，金黄色葡萄球菌CMCC26063株，大肠杆菌AS1505株，普通变形杆菌CMCC49101株，粪链球菌CMCC32221株，痢疾志贺氏菌CMCC51313株，淋病奈瑟球菌CMCC29106株，沙门氏菌属CMCC50336株，脆弱类杆菌CMCC81301株，青春双歧杆菌CMCC80202株，梭杆菌CMCC86102株，钩端螺旋体CMCC57603株，肺炎支原体CMCC97007株，解脲支原体CMCC99002株，星形奴卡氏菌ID356株等微生物来源于上海第二医科大学。
(二)试剂：原生质体形成缓冲液、原生质体裂解缓冲液按文献［5］配制，Novozym234系丹麦Novo Biolabs产品，TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs系美国Promega产品，Gene Releaser为美国Bioventure产品。
(三)反应模板制备：真菌基因组DNA的小量快速制备方法参照文献［5］，其它微生物和人体细胞(白细胞8份、表皮细胞4份)DNA的制备按文献［4］进行。
(四)临床标本处理：取临床标本(血液、组织、痰、甲屑等)10μl至PCR反应管中，加入Gene Releaser10μl、液体石蜡油30μl，沸水浴10分钟后用作反应模板。
(五)PCR反应及其质量控制：
1.引物：本研究使用的一对引物为真菌18SrDNA上的一段保守序列。经查阅Genebank确认与其它已知序列的物种无同源性。其碱基序列为：①AACTTAAA
GGAATTGACGGAAG；②GCATCACAGACCTGTTATTGCCT
C。可扩增出310bp的DNA片段。
2.反应体系：总体积50μl。其中含dNTPs200μmol/L、MgCl22mmol/L、引物各0.2μmol/L、10×PCR缓冲液5μl、TaqDNA聚合酶2U、模板DNA1μl或临床标本10μl。
3.反应条件及扩增产物检测：采用热启动方式。将除TaqDNA聚合酶以外的其它成分充分混匀，覆30μl液体石蜡油，在DNA热循环仪(Perkin Elmer)上加热至80℃时加入TaqDNA聚合酶，按以下条件扩增：94℃充分变性3分钟后，以94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟循环30次，72℃充分延伸5分钟。取10μl水相扩增产物作琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，中波紫外线观察、照相。
4.质量控制：每次实验均设置阴性和阳性对照，每份标本重复2次，结果相同者判为有效，否则再重做一次。并严格按Kwok等［6］的防污措施进行操作。
结 果
(一)热启动PCR用于检测真菌DNA的特异性：以本法对23种共42株医学上重要的真菌均如期扩增出一条310bp左右DNA片段(图1)，但对细菌、支原体、螺旋体、放线菌、人体细胞等均未能扩增。无模板的反应体系亦未能扩增出阳性结果。
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