孙晓非 佐伯公 鹤泽正仁 藤本孟男

【摘要】 目的 探讨抗癌药物对人B淋巴细胞白血病细胞株Nalm-6细胞凋亡(apoptosis)
的影响及周期特异性。 方法 临床常用的抗癌药物与Nalm-6细胞相互作用8～24小时后，
利用低倍体DNA-FCM测定法和TdT测定+DNA染色法进行检测。 结果 ADR、VP16、CPT、
MTX和Ara-C能明显诱导细胞凋亡，主要作用于S期。CPM、6MP和PRD则有较低的凋亡细胞
诱导率，CPM在大剂量时主要引起细胞坏死。6MP诱导G1和S期细胞凋亡，PRD诱导G1期细
胞凋亡，CPM诱导凋亡作用无明显的周期特异性。 结论 抗癌药物能诱导人B淋巴白血
病细胞株Nalm-6细胞凋亡。低倍体DNA-FCM测定法能检测细胞的凋亡率，TdT测定+DNA染
色法能呈现凋亡细胞与细胞周期的关系。临床上可利用此两种方法检测肿瘤细胞的凋亡
率，抗癌药物的疗效及其周期特异性。从而有助于化疗方案的设计及预后的评估。
【主题词】 白血病，B细胞 细胞凋亡 细胞周期 流式细胞术
抗肿瘤药 Nalm-6细胞
Apoptosis of B lymphocytic leukemia induced by anticancer drugs and their cell cycle
specificity Sun Xiaofei, Saeki Ko, Tsurusawa Masahito, et al. Department of
Medical Oncology, Cancer Hospital, Sun Yet-Sen University of Medical Sciences,
Guangzhou 510061

【Abstract】 Objective Evaluating the effect of apoptosis induced by anticancer
drugs on human B lymphocytic leukemia cell lines(Nalm-6) and their cell cycle specificity.
Methods alm-6 cells were treated with various anticancer drugs for 8～24 hours.
Apoptotic cells and their cell cycle specificity were measured by using hypodiploid
DNA-FCM and TdT assay+DNA staining. Results ADR, VP16, CPT, MTX,
Ara-C could markedly induce apoptosis of Nalm-6 cells in S phase. CPM, PRD,
6MP were less capable of inducing apoptosis. CPM in high dose resulted in cell n
ecrosis. PRD induced apoptosis in G1 phase, while 6MP induced apoptosis in G1
and S phase. The effect of CPM showed no marked cell cycle specificity. Conclusion
Hypodiploid DNA-FCM and TdT assay+DNA staining can be used to detect both
tumor cell apoptosis and their cell cycle specificity which is helpful to predict prognosis
and to design new chemotherapy regimen.
【Subject words】 Leukemia, B-cell Apoptosis Cell cycle Flow cytometry
Antineoplastic agents Nalm-6 cells
近年来，细胞凋亡研究的兴趣集中在肿瘤方面。放射线、高热、各种抗癌药和
去除生长因子均能引起肿瘤细胞发生凋亡［1］。越来越多的证据表明，抗癌治
疗的疗效与肿瘤细胞内部细胞凋亡的反应能力有关［2，3］。

抗癌药物能诱发肿瘤细胞发生凋亡，DNA链断裂、DNA退变为核苷酸或寡核苷
酸片断、染色质浓缩和核断片形成是细胞凋亡的主要特征［4］。我们利用流式
细胞仪等方法检测临床常用的抗癌药物(ADR、VP16、CPT、MTX、Ara-C、6MP、CPM
、PRD)对人B淋巴白血病细胞株产生凋亡的影响，同时利用检测DNA链断裂的末端
脱氧核酸基转移酶标记法(TdT assay)结合DNA染色法，分析凋亡细胞的周期特异
性。



材料与方法

1.试剂：PropidiumIodide(PI)和RNase购自Sigma化学公司；高纯度的多聚甲醛(PFA)
购自Polyscience, Inc(Warington, USA)；末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)、TdT反应
缓冲液和荧光素结合的dUTP(f-dUTP)购自Boehringer Mannheim(Indianapolis, IN)
；Methotrexate(MTX)购自レダリ一公司；Cytarabin(Ara-C):日本新药公司；
Adriamycin(ADR):日本协和发酵公司；Etoposide(VP16): Bristol-myers Squbb公司
；6-Mercaptopurine(6-MP)和Campto(CPT): Sigma公司；活性型环磷酰胺(CPM):日本
盐野义制药公司；强的松(PRD):日本和光纯药工业公司。

2.细胞株和药物处理：人B淋巴白血病细胞株Nalm-6由日本肿瘤库提供，在5%CO2
、37℃的条件下，生长在含有L-glutamine和10%小牛血清的RPMI-1640培养液中。每
次实验均在呈指数生长的细胞中进行。实验中的细胞密度为5×105/ml。细胞与各种浓
度的抗癌药物作用8～24小时。每次实验均设立对照组。细胞回收后，台盼蓝染色计
算细胞总数及成活率。然后PBS洗两次，70%冷乙醇或1%PFA固定，储存在-20℃待用。

3.凋亡细胞的检测方法：(1)低分子DNA抽提和PI染色：药物处理后的细胞经70%
冷乙醇固定，PBS洗两次后，去除上清，加200 μl PBS，制成细胞悬液，置于37℃水
浴中30分钟，然后PBS洗两次后，加入RNase(1 mg/ml)和PI(50 μg/ml)于细胞团中，
行DNA染色。

(2)DNA链断裂末端标记法(TdT assay)+DNA染色：药物处理后的细胞用1%PFA在0℃
下固定15分钟后，PBS洗两次，再用70%冷乙醇固定。固定后的细胞用PBS洗两次，加入
50 μlTdT反应缓冲液(10 μl of 5×concentrated buffer solution, 5 μl of 25
mmol/L coblt chloride, 0.5 μl 12.5 U of TdT, 0.25 nmoles of FITC-dUTP,
34.25 μl of distilled water)于细胞团中，然后置于37℃水浴中孵育60分钟，PBS
漂洗两次后，加入RNase(1 mg/ml)和PI(50 μl/ml)进行DNA染色。

(3)流式细胞仪：利用FACScan(Becton Dickinson)流式细胞仪进行所有的免疫荧
光检测，利用Becton Dickinson软件进行分析，利用FACS 440 cell sorter(Becton
Dickinson)进行细胞分选。分选出来的Sub-G1和G0/G1+S+G2/M期的细胞在荧光显微镜
下进行形态学的观察。每份标本分析10 000个细胞，细胞在488 nm处被氩激光激发
，PI的红荧光和FITC的绿荧光分别通过585 nm和530 nm滤光片收集。



结果

一、凋亡细胞的鉴别

药物处理后的细胞在流式细胞仪的DNA含量直方图中出现Sub-G1峰，即凋亡
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