周从容　陈贵安　薛爱玲

　　细胞凋亡不仅存在于正常的子宫内膜，也存在于增殖症和癌变的子宫内膜中［1，2］。研究发现，抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax对调节子宫内膜凋亡，维持正常月经周期起着重要作用［3，4］。本研究旨在探讨正常和异常子宫内膜，Bcl-2家族中Bcl-X基因的分布特点以及与凋亡的关系。
　　一、材料与方法
　　1.组织标本：子宫内膜组织标本55例，系1997年11月至1999年6月北京医科大学第三临床医学院妇产科于手术中收集，其中增殖期20例（早期6例、中期6例、晚期8例）和分泌期27例（早期8例、中晚期19例）子宫内膜标本，取自因子宫肌瘤、子宫内膜异位症行子宫切除术的患者；另外月经期8例子宫内膜取自因不孕症于月经第1天行诊断性刮宫术的患者。患者年龄25～45岁，月经周期规律，术前3个月内无性激素用药史。月经周期的判断是依据周期的时间、血清雌二醇、孕酮水平以及组织切片确定。增殖症子宫内膜18例（简单增生9例、复杂增生4例、不典型增生5例）及癌变子宫内膜13例（高分化5例、中分化6例、低分化2例）均取自因阴道异常出血行诊断性刮宫术和子宫切除术的患者。患者年龄31～68岁，术前未经化疗和放疗。增殖症和癌变子宫内膜按1988年国际妇科病理协会诊断标准分级。
　　2.实验方法：（1）免疫组织化学(免疫组化)法：标本经4%聚合甲醛固定，石蜡包埋、4 μm连续切片，按常规程序进行免疫组化检测。Bcl-XS/L工作液浓度为1∶50，二抗及辣根过氧化物酶标记链亲和素工作液浓度为1∶200。结果判定：采用双盲法观察结果。阳性细胞呈棕黄色，按染色强度分为：不着色为阴性（－），淡棕黄色为弱阳性（+），深棕黄色为强阳性（+++），阳性着色介于弱阳性至强阳性之间(++)。（2）Bcl-X蛋白的免疫印迹（Western blot）分析：11例子宫内膜标本（1例增殖中期，3例增殖晚期，2例分泌早期，3例分泌晚期，1例简单增生，1例中分化腺癌）。每例取约100 mg组织，在300 μl悬浮缓冲液中匀浆，以10 000 r/min离心10 min，收集上清液，取20 μl进行蛋白定量。其余上清液加入等量上述缓冲液后，于15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中20 mA电泳4 h，于4℃、40 V电转移至硝酸纤维素膜。封闭非特异性结合位点后，膜片于1%兔抗Bcl-X抗体室温反应3 h，于0.5%(V/V)辣根过氧化物酶二抗交联物室温反应1h后，膜片与ECL试剂反应1min，X线片曝光显影。
　　二、结果
　　1.正常和异常子宫内膜中Bcl-X的分布：在正常月经周期子宫内膜中，Bcl-X阳性表达主要位于腺上皮细胞的胞浆和核膜，增殖期阳性染色主要局限于基底层，分泌期和月经期，其阳性表达功能层强于基底层。除分泌晚期有部分间质细胞可见Bcl-X阳性染色外，其余各期间质细胞均未见Bcl-X表达，异常子宫内膜中，Bcl-X阳性表达也主要位于腺上皮细胞的胞浆和核膜。
　　2.正常月经周期子宫内膜中Bcl-X表达：增殖早中期，8例标本的腺上皮细胞中未见Bcl-X表达，仅4例标本呈弱阳性表达。增殖晚期、分泌期和月经期标本中都可见Bcl-X阳性着色，但分泌期27例中，22例呈阳性及强阳性染色，月经期标本8例中，3例阳性染色，5例强阳性染色。见表1。

表1　各月经周期患者子宫内膜Bcl-X表达(例数)


月经周期　 总例数 Bcl-X
- + ++ +++
增殖期
　早期 6
4 2 0
0
　中期 6 4 2 0 0
　晚期* 8 0 4 4 0
分泌期
　早期* 8 0 3 5 0
　中晚期* 19 0 2 13 4
月经期** 8 0 0 3 5

　　注：与增殖早、中期比较，*P<0.005；与增殖晚期、分泌早期比较，**P<0.05
　　3.增殖症子宫内膜中Bcl-X表达：在简单增生的子宫内膜腺体细胞中，均可检测到Bcl-X抗原的存在，大多数（6/9）呈弱阳性染色，复杂增生约50%、不典型增生约80%（4/5）为强阳性染色。各期阳性例数比较见表2。
　　4.癌变子宫内膜中Bcl-X表达：在大多数（9/12）癌变子宫内膜中，Bcl-X呈阳性染色，胞膜表达强于胞浆。高分化型5例Bcl-X表达均为阳性染色；中分化型5例中，1例弱阳性染色，4例阳性染色；低分化2例均为弱阳性染色，Bcl-X表达各型比较，差异无显著性(P>0.05)。

表2　不同类别增殖症患者子宫内膜Bcl-X表达(例数)


类别　 总例数 Bcl-X
+ ++ +++
简单增生 9 6 3 0
复杂增生 4 2 2 0
不典型增生* 5 0 1 4

　　* 与简单增生和复杂增生比较，P<0.01

　　5.Bcl-X蛋白免疫印迹分析：结果证实，Bcl-X以两种剪接产物存在于人类子宫内膜中，且分泌期Bcl-X蛋白含量高于增殖期，这与免疫组化结果一致。增殖期子宫内膜中主要存在Bcl-XL，分泌期子宫内膜中存在Bcl-XL和Bcl-Xs两种产物，以Bcl-XL为主，参照Boise等［5］的滴度曲线，Bcl-XL/ Bcl-Xs约为10∶1。简单增生的子宫内膜中，主要是存在Bcl-XL。中分化腺癌的子宫内膜中，同时存在Bcl-XL和Bcl-Xs，也是以Bcl-XL为主，Bcl-XL/Bcl-Xs约为8∶1。
　　三、讨论
　　1. Bcl-X与月经周期子宫内膜变化的关系：有研究证明，由于mRNA剪接方式不同，使Bcl-X基因产生两种功能完全相反的蛋白质Bcl-XL和Bcl-Xs。Bcl-XL功能与Bcl-2相似，能抑制细胞凋亡，即使在没有Bcl-2表达的情况下，也能抑制细胞凋亡，促进细胞存活；Bcl-Xs功能相似于Bax基因，能抑制Bcl-2的活性而促进细胞凋亡［5］。本研究结果显示，正常月经周期子宫内膜中，从增殖期至分泌期、月经期，Bcl-X表达逐渐增强，强阳性表达主要出现在分泌晚期和月经期。免疫印迹结果证实，子宫内膜中Bcl-X含量在分泌期高于增殖期；增殖期内膜中主要存在Bcl-XL，而在分泌期内膜中，同时存在Bcl-XL和Bcl-Xs，但以前者为主。结合免疫组化定位结果提示，Bcl-XL与Bcl-2一样在增殖期内膜的基底层细胞中出现，可能与Bcl-2一起抑制基底层腺上皮细胞凋亡，促进细胞增殖，保证了经历月经期脱落的子宫内膜从基底层修复再生。而在分泌期，Bcl-2低表达甚至无表达时，Bcl-XL的表达最强，且Bcl-XL/Bcl-Xs为10∶1，提示Bcl-XL的存在可能是作为Bax的对抗因子，使局部腺上皮细胞对Bax诱导的凋亡产生免疫耐受。这似乎可以解释在Bax高表达的情况下，仅有少量的凋亡细胞。
　　2.Bcl-X表达异常与内膜的异常增生有关：有研究发现，Bcl-X的表达方式明显与Bcl-2不同，认为Bcl-X和Bcl-2是在细胞分化的不同时期调节细胞的生存和死亡［6］。本研究首次观察了增殖症和癌变子宫内膜中Bcl-X的表达。结合Bcl-X和Bcl-2在增殖症和癌变子宫内膜中的表达结果［3］推测，当Bcl-2处于低表达或无表达时，Bcl-X的高表达可能在于发挥了它抑制细胞凋亡、促进细胞存活的功能，最终使细胞丧失自发凋亡的反应能力，因此，在肿瘤细胞的异常增殖和发展过程中起重要作用。
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