郝敏　石一复　周彩云

　　【摘要】　目的　探讨异位子宫内膜间质细胞分泌催乳素（PRL）与子宫内膜异位症（内异症）患者腹水中高PRL水平的关系。方法　对12例内异症患者的异位内膜及12例正常育龄妇女的在位子宫内膜进行体外细胞分离、培养。两种内膜间质细胞在加入10-8mol/L浓度孕酮培养6 d后，用酶联免疫吸附试验法测定其分泌的PRL水平；并对异位内膜间质细胞分泌PRL 水平与美国生育协会（AFS）修正标准分期评分进行相关性分析。采用免疫细胞化学法检测PRL蛋白在两种间质细胞中的表达。结果　异位及在位内膜间质细胞分泌相似量的PRL,分别为1×105个细胞（21.8±8.0）和（24.5±7.9）μg．L-1．6 d-1(P>0.05)，异位内膜间质细胞分泌的PRL与AFS评分呈正相关(P<0.05)。免疫细胞化学染色，PRL在两者的积分分别为4.1±0.8和4.3±0.9(P>0.05)。结论　异位病灶分泌的PRL是内异症患者腹腔液中PRL升高的原因之一。
　　【关键词】　子宫内膜异位症； 间质细胞； 细胞，培养的； 催乳素

In Vitro Study of Prolactin Secretion by Ectopic Endometrial Stromal Cells

HAO Min, SHI Yifu, ZHOU Caiyun.
（Department of Gynecology, Obstetrics and Gynecology Hospital, Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310006, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the relationship between prolactin (PRL )secretion by ectopic endometrial stromal cells and elevated PRL concentrations of peritoneal fluid in patients with endometriosis. Methods　Twelve samples of each ectopic endometrium and normal endometrium were separated and cultured in vitro. After stimulated with progesterone(10-8 mol/L) for 6 days, PRL levels in the media of cultured stromal cells from both tissue types were measured by enzyme-labeled immunosorbent assay（ELISA）. A study of correlation between PRL level in culture supernatant of stromal cells from ectopic endometrium and American Fertility Society(AFS) classification of endometriosis score was performed. The expression of PRL protein of stromal cells from both tissue types were determined by immunocytochemical method. Results　PRL was secreted in similar concentrations by stromal cells from both tissue types. The mean levels of PRL in ectopic and normal endometria were (21.8 ±8.0) and (24.5±7.9) μg．L-1．6 d-1 per, respectively (P>0.05). There is significant positive correlation between PRL secretion by ectopic endometrial stromal cells and the scoring of endometriosis (P<0.05). There were no significant difference in the immunostaining integral score of PRL between the two groups. Conclusion　Production of PRL by ectopic implants of endometriosis is likely to be a contributing factor of the elevated peritoneal fluid PRL in patients with endometriosis.
　　【Key words】　Endometriosis; Stromal cells; Cells, cultured; Prolactin

　　 子宫内膜异位症（内异症）与不孕密切相关，也常与卵巢内分泌失调并存。近年来，内异症伴有高泌乳血症合并不孕的现象日益受到重视。许多报道证实，内异症患者腹腔液中催乳素（PRL）水平明显高于正常妇女，但血清、腹腔液中PRL增高是否直接与异位的子宫内膜有关，尚不清楚。本研究对分离的异位内膜间质细胞进行体外培养，检测其PRL的表达和分泌水平，探讨异位内膜间质细胞分泌PRL情况及与腹腔液中PRL水平升高的关系。

资料与方法

　　一、研究对象
　　异位内膜取自1997年8月至1998年10月在我院因卵巢子宫内膜异位囊肿开腹手术的住院患者（内异症组），共12例。根据美国生育协会（AFS）修正标准分期进行评分，Ⅲ期6例、Ⅳ期6例；对照组为同期本院门诊正常育龄妇女，共12例，于放置宫内节育器前行刮宫术获取子宫内膜。两组取材均在月经周期的第7～13天，术前3个月内未服用过激素类药物，年龄分别为（29.5±4.2）和（32.1±4.9）岁(P>0.05)。标本取材后即置入4℃的不含钙、镁的无菌Hanks平衡液中（D-HBSS），立即送实验室进行培养。全部标本均留部分用10%甲醛液固定后行组织学检查，证实内异症组均为卵巢内异症，对照组内膜无病理改变。
　　二、方法
　　1．细胞分离及培养：参照文献［1，2 ］的方法略作改进。所获异位与在位子宫内膜组织用D-HBSS液洗涤3次，剪成约0.5～1.0 mm大的碎块，分别加入组织容积2.5～5.0倍的0.1%胶原酶及0.25%胰蛋白酶（均为美国Sigma公司产品）消化液，置37℃水浴中持续振荡消化，时间为80～160 min，消化后的细胞悬液含单个间质细胞及葡萄串状腺上皮细胞,用38 μm的尼龙网过滤行细胞分离，将滤液（主要含单个间质细胞）经1 000 r/min离心10 min，所得到的沉淀物用D-HBSS液漂洗后，加入1∶1Dulbecco′s Modified Eagle Medium/F12(美国GIBCO公司产品，含15%胎牛血清)培养液制成细胞悬液，经台盼蓝染色行细胞计数,调整细胞浓度为每孔1×105个/ml，接种入6孔板和24孔板，置37℃、5%二氧化碳孵育箱内培养。至细胞汇聚完成原代培养需5～6 d。
　　2．角蛋白、波形蛋白和PRL免疫细胞化学染色： 从6孔培养板中取出长满异位及正常在位内膜间质细胞的盖玻片，用0.25%戊乙醛固定10～15 min，分别用鼠抗人细胞角蛋白和波形蛋白单克隆抗体及兔抗人PRL多克隆抗体作SP免疫细胞化学染色(均为福建迈新公司产品)，再用苏木素复染，凡细胞质染成棕黄色为角蛋白、波形蛋白或PRL阳性细胞，未显棕黄色为阴性细胞，每次染色取子宫内膜作阳性对照，用磷酸缓冲液代替第1抗体作阴性对照。异位及正常在位内膜间质细胞为波形蛋白呈阳性反应，角蛋白呈阴性反应。实验结果每片经显微镜下随意选取5个高倍视野（放大200）记数，并得出阳性细胞百分率（百分率≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分, ＞75%为4分）;着色强度以多数阳性细胞呈现的染色计分(无色为0分，浅棕黄色为1分，深棕黄色为2分) 。百分率计分与着色强度计分相加为PRL积分。
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