摘要：采用蔗糖密度梯度离心法(95000×g，2 h)提取大鼠肝细胞过氧化物酶体，所得过氧化物酶体形态完整，纯度与肝匀浆相比提高了26倍，仅有少量(0.5%～0.9%)的微粒体和线粒体污染，回收率为12%。为研究过氧化物酶体提供了有效的分离方法。此法还可将过氧化物酶体、微粒体、线粒体同时进行分离。
关键词：过氧化物酶体；细胞器；超速离心；提取
作者：骆子生 王敏彦 姜玲玲
The Isolation of Peroxisomes from rat liver
Luo Zisheng Wang Minyan Jiang Lingling 大鼠肝细胞过氧化物酶体的提取，是研究过氧化物酶体的重要条件之一。目前，人们对研究过氧化物酶体，特别是研究过氧化物酶体的磷脂和脂肪酸引起广泛兴趣。因此，建立有效的提取过氧化物酶体的方法，具有重要意义。本文介绍的采用蔗糖密度梯度离心法提取大鼠肝细胞过氧化物酶体，具有操作简单、可行，所得过氧化物酶体形态完整，回收率高等特点。现报道如下。 1.1 动物 2.1 过氧化物酶体从肝组织中的分离：肝匀浆经离心除去细胞核(A)，胞浆微粒体(B)后，得到了富含过氧化物酶体的C组分。如表1所示，C组分中过氧化物酶体的回收率为53%(过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，回收率由此酶的活性计算而得)；线粒体回收率为58%(谷氨酸脱氢酶是线粒体的标志酶，回收率由此酶的活性计算而得)；微粒体回收率为16%(NADPH-细胞色素C还原酶是微粒体的标志酶，回收率由此酶的活性计算而得)。C组分经蔗糖密度梯度离心后，得到的过氧化物酶体(Ⅰ)，其回收率为12%，纯度与肝匀浆相比，提高了26倍。C组分中的线粒体、微粒体大部分被除去(见表1)。
(Institute of Basic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017)A modified method for isolating of peroxisomes from rat liver was described. The peroxisome-enriched fraction was put onto discontinuous sucrose density gradients and then centrifuged for 2 h at 95000×g. It was found that the peroxisomes obtained with this method were intact, and contained only minute amounts (0.5%～0.9%) cellular mitochondria and microsomes. The purity of the peroxisome was increased 26-fold compared with the liver homogenate. The final yield of peroxisomes was about 12%. The peroxisomes, mitochondria and microsomes could be separated at the same time by this method which provided a basis for the study of peroxisomes. Key words:Peroxisome; Organelle; Ultracentrifuge; Isolation
健康SD大鼠，体重300 g左右，鼠龄2～3个月。由河北省实验动物中心提供。
1.2 试剂
所用试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 主要仪器
日立80P—7超速离心机，RPS40T水平转头，日立UV330紫外—可见分光光度计。
1.4 过氧化物酶体的分离
大鼠断头处死后，立即取出肝脏，用冷生理盐水将血迹冲洗干净。称取10 g肝脏，用剪子剪碎后，加50 ml提取缓冲液(蔗糖0.25 mol/L，乙醇0.1%，Na3EDTA 1 mmol/L，Tris-HCl pH7.4，10 mmol/L)，在冰浴中匀浆(以下操作均在冰浴中进行)。肝匀浆3000 r/min、4℃离心10 min，除去组织块，取上清液备用。向沉淀中加入50 ml提取缓冲液再次匀浆，肝匀浆3000 r/min、4℃离心6 min，弃沉淀(A)。将两次离心所得上清液合并，7000 r/min、4℃离心5 min，取上清。13500 r/min、4℃离心20 min，弃上清(B)，留沉淀。向沉淀中加入40 ml缓冲液混悬后，再次13500 r/min、4℃离心20 min，弃上清，取沉淀。用3 ml缓冲液将沉淀悬浮，此为过氧化物酶体的粗提物(C)。在13 ml的PA离心管中加入45.8%(w/w)的蔗糖液5 ml，再缓慢加入37.4%(w/w)的蔗糖液4 ml，制成不连续梯度液。将混悬好的过氧化物酶体的粗提物(约4 ml)缓慢加在梯度液上 ，用RPS40T水平转头，慢加速至27500 r/min、4℃离心2 h。样品被分成肉眼可见的三层分布状态(见图1)：上边一层是微粒体(Ⅲ)，中间一层是线粒体(Ⅱ)，最底部沉淀即是过氧化物酶体(Ⅰ)。收集管底的沉淀，用13 ml提取缓冲液悬浮，27500 r/min、4℃离心2 h，洗去浓蔗糖溶液。
1.5 蛋白质测定
以牛血清白蛋白为标准，用紫外吸收法测定。
1.6 酶活性测定
用分光光度法，240 nm波长下测定过氧化氢酶的活性［1］；340 nm波长下测定谷氨酸脱氢酶的活性［2］；550 nm波长下测定NADPH—细胞色素C还原酶的活性［3］。
1.7 电镜样品制备
离心至管底的过氧化物酶体，按常规方法固定、脱水、包埋、切片、染色、透射电镜观察。
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