邱德义　沈炳福

摘要：　采用基因定位突变的方法，在体外把来自pBR322的四环素抗性(Tcr)基因片段插入由pST1142质粒所携带的阴沟肠杆菌nifL基因3'-端的SmaⅠ位点，再经细胞体内同源基因片段的重组交换，选择获得了在染色体上nifL突变的阴沟肠杆菌E12和E13，两者Tcr基因插入nifL的转录方向相反。经分析显示，E13(nifL-)由于Tcr基因插入后，在nifA上游产生具有启动子功能的核苷酸序列(-TTTCATA-)，激活nifA的表达。当E13和E12被引入多拷贝组成型nifA质粒pBF101后，在有氨条件下nif基因去阻遏表达，呈高的固氮酶活力，与野生型E26(pBF101)比较，其比活力提高近1倍。
关键词：　基因表达,nifL,nifA,阴沟肠杆菌

Construction of Genetically Engineered Strains of Enterobacter cloacae (nifL Ac) by Gene Targeting Mutation

QIU De-Yi and SHEN Bing-Fu

Shanghai Institute of Plant Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032

Abstract：　E. cloacae E26 nifL mutation in chromosome was constructed by in vitro insertion of Tcr gene into the SmaⅠ site located in the nifL 3'-terminus of plasmid pST1142 and by in vivo homologous DNA recombination (Fig.1). Recombinants (E12 and E13) were obtained by selection, both had Tcr gene inserted in the chromosome nifL in the opposite transcription orientation. A promoter-like nucleotide sequence (-TTT CATA-) was produced in the upstream region of the nifA in E13.
　　We investigated the effect of the nifL mutation on the nif gene transcription in E. cloacae by monitoring β-galactosidase synthesis and assaying acetylene-reduction. Recombinant E12 has lost the nitrogen fixation activity. The gene nifA was expressed constitutively in E13, and nitrogenase activity was derepressed to a low level in the presence of NH+4 . In both E13 and E12, carrying a multicopy plasmid pBF1　0　1 with the constitutive nifA,
a nitrogenase activity as high as 66% in an excess of NH+4 was constitutively expressed (Tables 2，3). The recombinant strains (nifL-Ac) thus obtained will be useful in enhancing associative nitrogen fixation in the rhizosphere of rice plants.
Key　words: gene expression, nifL, nifA, Enterobacter cloacae

　　阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) E26是繁衍在水稻根际的固氮菌，能与水稻进行有效的联合固氮(Qiu 等 1981)。但是这种固氮作用易受土壤中结合态氮的抑制，因此，消除氨对细菌固氮作用的阻遏，以使固氮菌与植株间的联合固氮能力不致因氨态氮的存在而减弱(或消失)，从而维护了其固氮功能和节肥与保护生态环境的作用的发挥。
　　阴沟肠杆菌nif基因的表达受基因nifLA的调控。nifLA构成一个操纵子，nifA编码的nifA蛋白(NifA)是正调节因子，激活nif基因的表达(Zhu等1986); nifL编码nifL蛋白(NifL)，作为负调节因子，在有氨条件下，NifL作用于NifA使其失活，阻遏nif基因的表达 (待发表)。我们通过基因定位突变等方法，构建了在染色体上nifL突变以及nifA组成型表达的工程菌株，并对其nif基因表达特性进行分析。
1　材料与方法
1.1　菌株和质粒　所用菌株和质粒列于表1。
1.2　菌株培养条件　细菌在LB或NFDM培养基上于30℃或37℃培养。抗菌素使用浓度：卡那霉素(Km) 20μg/ml，四环素(Tc) 10μg/ml，氯霉素(Cm) 20μg/ml。
1.3　固氮酶活力测定　用乙炔还原法 (Dilworth 1966)。
1.4　质粒制备和分析　按Davis等(1980)方法。
2　结果
2.1　阴沟肠杆菌nifL基因突变的构建
2.1.1　nifL突变重组质粒的构建　 把来自质粒pBR322含四环素抗性(Tcr)基因的EcoRⅠ-StyⅠ DNA 片段，经Klenow酶处理成平头后，再插入由质粒pST1142所携带的nifL基因3'-端的SmaⅠ 位点，因平头连接，Tcr基因有两个不同方向的插入。经酶切分析显示，插入后Tcr基因转录方向与nifLA操纵子转录方向一致的嵌合质粒称之为pDY208;反之，称为pDY209(见图1)。

表1　菌株和质粒

Table 1　Genotypes and phenotypes of the strains of bacteria and plasmids used

Strain/plasmid Genotype or phenotype Source or reference
Bacterial strains 　 　
Escherichia coli 　 　
　　YMC9 endA1thi-1hsdR17 LacΔu169 Backman et al.1981
　　HB101 recA, rpsL20 Boyer et al.1969
Enterobacter cloacae
　
　
　　E26 wild type Qiu et al. 1981
　　E12 nifL-Nif- This work
　　E13 nifL-Nif+ This work
　　E1297 nifL-Tn5-nifAc This work
　　E1397 nifL-AcTn5-nifAc This work
Plasmids 　 　
　pBR322 AprTcr
　
　pST1142 Kmr, E26 nifLAc Zhu et al.1986
　pBF101 KmrCmr, Tn5-E26 nifA Shen et al.1995
　pDY208 TcrKmr, Tcr gene inserted into nifL of pST1142 This work
　pDY209 Same as pDY208, but Tcr in the opposite　transcription orientation This work
　pDY210 Deletion of BamHⅠ-BamHⅠ in pDY209 This work



图1　重组质粒pDY208和pDY209的构建示意

Fig.1　Construction of the plasmids pDY208 and pDY209

Ba: BamHⅠ, RI: EcoRⅠ, Rv: EcoRⅤ, P: PstⅠ, Sm:　SmaⅠ, St: StyⅠ．

　　质粒pST1142，带有E26 nifA和部分nifL基因，受氨苄青霉素抗性(Apr)基因启动子的控制，因此nifA呈组成型表达。为观察Tcr基因插入nifL基因后，对nifA表达所产生的影响，我们把质粒pDY208和pDY209分别导入依赖NifA激活的肺炎克氏杆菌nifH-LacZ融合菌株YMC9(pVSA2)，测定β-半乳糖苷酶的活力(表2)。结果显示，质粒pDY208激活的β-半乳糖苷酶活力比对照(pST1142)明显下降了90％以上，Tcr基因的插入影响了nifA的表达；而质粒pDY209激活的β-半乳糖苷酶活力为3　822单位，与pST1142相近，似乎Tcr基因的插入未影响nifA的表达。为此我们对重组质粒DNA序列进行分析，结果显示，在pDY209质粒nifA的上游产生了一个类似启动子的-TTTCATA-序列；同时我们构建了pDY209缺失Apr基因启动子和大部分Tcr基因片段的质粒pDY210 (即保留-TTTCATA-序列)，检测结果同样显示β-半乳糖苷酶的高活性。证明了-TTTCATA-序列具有启动子功能，激活nifA的表达。
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