张林 曾因明 陈群
【摘要】 目的 观察低温、巴曲酶及巴曲酶复合低温对沙土鼠全脑缺血后海马组织Na＋-K＋-ATP酶，Ca2＋-ATP酶活性的影响。方法 利用沙土鼠全脑缺血模型，观察全脑缺血10分及再灌20分、60分时，低温、巴曲酶及巴曲酶复合低温对海马组织Na＋-K＋-ATP酶，Ca2＋-ATP酶活性的影响。应用酶法测定ATP酶活性。结果 全脑缺血10分后Na＋-K＋-ATP酶，Ca2＋-ATP酶活性明显下降(P＜0.01)。低温组在各时间点均高于常温组(P＜0.01)；巴曲酶复合低温组ATP酶活性高于单独的低温或巴曲酶组(P＜0.05)。结论 巴曲酶复合低温能促进脑缺血再灌注期间ATP酶活性的恢复，其作用强于单独的低温或巴曲酶治疗。
【关键词】 再灌注损伤 毒蛇凝血酸 低温 Na（＋）K（＋）交换ATP酶 Ca(2＋)转运ATP酶
Effect of batroxobin combined with hypothermia on ATPase activity during global isechmia reperfusion
ZHANG Lin，ZENG Yinming，CHEN Qun.
Jiangsu Province Key Lab of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002
【Abstract】 Objective To investigate the effect of hypothermia，batroxobin and batroxobin combined hypothermia on the activity of Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-ATPase in hippocampus tissues after cerebral ischemia in rats.Methods The cerebral ischemia of rats，produced by occluding both carotid arteries，were treated with hypothermia，batroxobin or batroxobin combined with hypothermia.The values of Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-ATPase activity in hippocampus tissues were measured with enzyme assay method 10min after total cerebral ischemia，20min and 60min after reperfusion.Results Comparing with controlled values，the Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-ATPase activity decreased significantly 10min after total cerebral ischemia (P＜0.01)，which were higher in hypothermia group than normothermia group at each time point (P＜0.01).The ATPase activity values were higher in batroxobin combined with hypothermia group than single hypothermia or single batroxobin group (P＜0.05).Conclusion Batroxobin combined with hypothermia may improve the recovery of ATPase activity during reperfusion after cerebral ischemia， the effect of which is much more better than single hypothermia or single batroxobin therapy.
【Key words】 Reperfusion injury Reptilase Hypothermia Na(＋)-K(＋)-exchanging ATPase Ca(2＋)-transporting ATPase
细胞Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶的活性可反应细胞膜的功能。脑缺血后Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性的改变是神经元损伤的重要环节之一。若能预防或减轻因缺血引起的Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性的降低，则有可能防止膜功能的衰竭和缺血再灌注损伤的发生发展。大量临床和实验结果均表明低温能减轻脑缺血再灌注损伤。巴曲酶(Batroxobin)能明显抑制缺血所致的细胞外兴奋性氨基酸(EAA)水平的增高，减轻兴奋毒性［1］，还具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用［2］。本文旨在观察低温、巴曲酶及巴曲酶复合低温对缺血再灌注期间海马组织Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性的影响。
材料与方法
药物、试剂与仪器 巴曲酶为日本东菱工业株式会社产品，其余试剂均为进口或国产分析纯。HITACHI R22A冷冻高速离心机，HARRIS超低温冰箱。
动物与分组 60只沙土鼠，体重50～80g，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为6组：假手术组(1组，6只)，缺血对照组(2组，6只)，常温组(3组，12只)，低温组(32℃，4组，12只)，巴曲酶组(5组，12只)，巴曲酶复合低温组(6组，12只)，除缺血对照组外，其余各组又分为两亚组，再灌注20分钟、60分钟组，每组6只动物。
实验步骤 动物模型制备：沙土鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉。剪开颈部皮肤，分离双侧颈总动脉，动脉夹夹闭双侧颈总动脉建立全脑缺血模型。夹闭10分钟，然后松开动脉夹使其再灌流。所有用药组动物于动脉夹夹闭5分钟给予腹腔注射巴曲酶(8NU/kg)。用药前巴曲酶用生理盐水稀释一倍。假手术组及其他非用药组给予等容生理盐水。
脑温控制及测定 采用热敏电阻探头，连续监测鼓膜温度［3］。对需要降温的动物使用冰袋全身降温至(32±0.5)℃。正常体温动物置于空气浴箱保温。
脑组织ATP酶活性的测定 动物断头处死，冰面上取脑及海马，置于(0～4)℃0.32mol/L蔗糖缓冲液中冲洗，按文献方法匀浆。Lowery法测定蛋白含量，－75℃保存待测酶活力。应用钼蓝分光光度法测定ATP酶活性。测定Na＋-K＋-ATP酶活性时，脑匀浆与反应液体积比为1∶2，总体积200μl；测定Ca2＋-ATP酶活性时，脑匀浆与反应液体积比为1∶10，总体积400μl；37℃下酶反应20分钟，用5%十二烷基硫酸钠(SDS)40μl终止反应后，3 000r.min－1离心10分钟，取上清液定磷［5］。酶活力单位以每小时(h)分解每毫克组织蛋白(mg.prot)产生的无机磷(pi)的含量(μmol)来表示，单位μmol.pi.mg.prot－1.h－1。
统计学处理 所有数据用均值±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05认为有统计学意义。
结 果
对Na＋-K＋-ATP酶活性的影响 全脑缺血10分钟后海马组织Na＋-K＋-ATP酶活性明显下降。常温(36℃)下再灌注20分钟、60分钟酶活性低于假手术组，低温(32℃)、常温巴曲酶组，再灌注20分钟、60分钟酶活性高于常温组。低温复合巴曲酶，再灌注20分钟时活性较单纯低温组增高(P＜0.05)，亦较常温复合巴曲酶组增高(P＜0.05)，见表1。
表1 Na＋-K＋-ATP酶的活性的变化(±s，μmol.pi.prot－1.h－1)
组别 缺血10分钟 再灌20分钟 再灌60分钟
1 8.31±0.33
2 4.08±0.76
3 3.99±0.63 4.46±0.41
4 6.37±0.67* 6.79±0.42*
5 6.63±0.54* 6.43±0.57*
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【摘要】 目的 观察低温、巴曲酶及巴曲酶复合低温对沙土鼠全脑缺血后海马组织Na＋-K＋-ATP酶，Ca2＋-ATP酶活性的影响。方法 利用沙土鼠全脑缺血模型，观察全脑缺血10分及再灌20分、60分时，低温、巴曲酶及巴曲酶复合低温对海马组织Na＋-K＋-ATP酶，Ca2＋-ATP酶活性的影响。应用酶法测定ATP酶活性。结果 全脑缺血10分后Na＋-K＋-ATP酶，Ca2＋-ATP酶活性明显下降(P＜0.01)。低温组在各时间点均高于常温组(P＜0.01)；巴曲酶复合低温组ATP酶活性高于单独的低温或巴曲酶组(P＜0.05)。结论 巴曲酶复合低温能促进脑缺血再灌注期间ATP酶活性的恢复，其作用强于单独的低温或巴曲酶治疗。
【关键词】 再灌注损伤 毒蛇凝血酸 低温 Na（＋）K（＋）交换ATP酶 Ca(2＋)转运ATP酶
Effect of batroxobin combined with hypothermia on ATPase activity during global isechmia reperfusion
ZHANG Lin，ZENG Yinming，CHEN Qun.
Jiangsu Province Key Lab of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002
【Abstract】 Objective To investigate the effect of hypothermia，batroxobin and batroxobin combined hypothermia on the activity of Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-ATPase in hippocampus tissues after cerebral ischemia in rats.Methods The cerebral ischemia of rats，produced by occluding both carotid arteries，were treated with hypothermia，batroxobin or batroxobin combined with hypothermia.The values of Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-ATPase activity in hippocampus tissues were measured with enzyme assay method 10min after total cerebral ischemia，20min and 60min after reperfusion.Results Comparing with controlled values，the Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-ATPase activity decreased significantly 10min after total cerebral ischemia (P＜0.01)，which were higher in hypothermia group than normothermia group at each time point (P＜0.01).The ATPase activity values were higher in batroxobin combined with hypothermia group than single hypothermia or single batroxobin group (P＜0.05).Conclusion Batroxobin combined with hypothermia may improve the recovery of ATPase activity during reperfusion after cerebral ischemia， the effect of which is much more better than single hypothermia or single batroxobin therapy.
【Key words】 Reperfusion injury Reptilase Hypothermia Na(＋)-K(＋)-exchanging ATPase Ca(2＋)-transporting ATPase
细胞Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶的活性可反应细胞膜的功能。脑缺血后Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性的改变是神经元损伤的重要环节之一。若能预防或减轻因缺血引起的Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性的降低，则有可能防止膜功能的衰竭和缺血再灌注损伤的发生发展。大量临床和实验结果均表明低温能减轻脑缺血再灌注损伤。巴曲酶(Batroxobin)能明显抑制缺血所致的细胞外兴奋性氨基酸(EAA)水平的增高，减轻兴奋毒性［1］，还具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用［2］。本文旨在观察低温、巴曲酶及巴曲酶复合低温对缺血再灌注期间海马组织Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性的影响。
材料与方法
药物、试剂与仪器 巴曲酶为日本东菱工业株式会社产品，其余试剂均为进口或国产分析纯。HITACHI R22A冷冻高速离心机，HARRIS超低温冰箱。
动物与分组 60只沙土鼠，体重50～80g，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为6组：假手术组(1组，6只)，缺血对照组(2组，6只)，常温组(3组，12只)，低温组(32℃，4组，12只)，巴曲酶组(5组，12只)，巴曲酶复合低温组(6组，12只)，除缺血对照组外，其余各组又分为两亚组，再灌注20分钟、60分钟组，每组6只动物。
实验步骤 动物模型制备：沙土鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉。剪开颈部皮肤，分离双侧颈总动脉，动脉夹夹闭双侧颈总动脉建立全脑缺血模型。夹闭10分钟，然后松开动脉夹使其再灌流。所有用药组动物于动脉夹夹闭5分钟给予腹腔注射巴曲酶(8NU/kg)。用药前巴曲酶用生理盐水稀释一倍。假手术组及其他非用药组给予等容生理盐水。
脑温控制及测定 采用热敏电阻探头，连续监测鼓膜温度［3］。对需要降温的动物使用冰袋全身降温至(32±0.5)℃。正常体温动物置于空气浴箱保温。
脑组织ATP酶活性的测定 动物断头处死，冰面上取脑及海马，置于(0～4)℃0.32mol/L蔗糖缓冲液中冲洗，按文献方法匀浆。Lowery法测定蛋白含量，－75℃保存待测酶活力。应用钼蓝分光光度法测定ATP酶活性。测定Na＋-K＋-ATP酶活性时，脑匀浆与反应液体积比为1∶2，总体积200μl；测定Ca2＋-ATP酶活性时，脑匀浆与反应液体积比为1∶10，总体积400μl；37℃下酶反应20分钟，用5%十二烷基硫酸钠(SDS)40μl终止反应后，3 000r.min－1离心10分钟，取上清液定磷［5］。酶活力单位以每小时(h)分解每毫克组织蛋白(mg.prot)产生的无机磷(pi)的含量(μmol)来表示，单位μmol.pi.mg.prot－1.h－1。
统计学处理 所有数据用均值±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05认为有统计学意义。
结 果
对Na＋-K＋-ATP酶活性的影响 全脑缺血10分钟后海马组织Na＋-K＋-ATP酶活性明显下降。常温(36℃)下再灌注20分钟、60分钟酶活性低于假手术组，低温(32℃)、常温巴曲酶组，再灌注20分钟、60分钟酶活性高于常温组。低温复合巴曲酶，再灌注20分钟时活性较单纯低温组增高(P＜0.05)，亦较常温复合巴曲酶组增高(P＜0.05)，见表1。
表1 Na＋-K＋-ATP酶的活性的变化(±s，μmol.pi.prot－1.h－1)
组别 缺血10分钟 再灌20分钟 再灌60分钟
1 8.31±0.33
2 4.08±0.76
3 3.99±0.63 4.46±0.41
4 6.37±0.67* 6.79±0.42*
5 6.63±0.54* 6.43±0.57*
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